什么是紫外分光光度計(jì)？原理、優(yōu)勢(shì)、局限性及應(yīng)用

紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)光譜是一種廣泛應(yīng)用于許多科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)，從細(xì)菌培養(yǎng)、藥物鑒定和核酸純度檢查和定量，到飲料行業(yè)的質(zhì)量控制和化學(xué)研究。本文將介紹UV-Vis光譜的工作原理、如何分析輸出數(shù)據(jù)、該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和局限性以及它的一些應(yīng)用。

什么是紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)？

UV-Vis光譜是一種分析技術(shù)，它測(cè)量與參考或空白樣品相比樣品吸收或透射過(guò)的UV或可見(jiàn)光的離散波長(zhǎng)的數(shù)量。此屬性受樣品成分的影響，分析結(jié)果可能會(huì)提供有關(guān)樣品中成分和濃度的信息。由于這種光譜技術(shù)依賴于光的使用，所以讓我們首先談一談光的特性。

光具有與其波長(zhǎng)成反比的一定量的能量。因此，較短波長(zhǎng)的光攜帶更多的能量，而較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光攜帶較少的能量。需要特定量的能量來(lái)將物質(zhì)中的電子提升到更高的能量狀態(tài)，我們可以將其檢測(cè)為吸收。物質(zhì)中不同鍵合環(huán)境中的電子需要不同的特定能量來(lái)將電子提升到更高的能量狀態(tài)。這就是為什么在不同物質(zhì)中對(duì)不同波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生光吸收的原因。人類能夠看到一系列可見(jiàn)光，從大約380nm（我們看到的紫色）到780nm（我們看到的紅色）。紫外光的波長(zhǎng)比可見(jiàn)光短，約為100nm。因此，光可以通過(guò)其波長(zhǎng)來(lái)描述，這在UV-Vis光譜中可用于通過(guò)定位與大吸光度相對(duì)應(yīng)的特定波長(zhǎng)來(lái)分析或識(shí)別不同的物質(zhì)（參見(jiàn)下文中UV-Vis光譜的應(yīng)用部分）。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)如何工作？

雖然UV-Vis分光光度計(jì)有許多類型，但為了更好地了解UV-Vis分光光度計(jì)的工作原理，我們主要考慮分光光度計(jì)的主要組件，如下圖1所示。

圖1：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)主要組件的示意圖。

1、光源

作為一種基于光的技術(shù)，一個(gè)能夠在很寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射光的穩(wěn)定光源是必不可少的。單個(gè)氙氣燈通常用作紫外線和可見(jiàn)光范圍的高強(qiáng)度光源。然而，與鎢燈和鹵素?zé)粝啾?，氙氣燈的成本更高且穩(wěn)定性較差。

對(duì)于使用兩個(gè)燈的儀器，鎢燈或鹵素?zé)敉ǔＳ糜诳梢?jiàn)光，而氘燈是紫外光的常見(jiàn)光源。由于需要兩種不同的光源來(lái)掃描紫外和可見(jiàn)波長(zhǎng)，因此在測(cè)量過(guò)程中須切換儀器中的光源。在實(shí)踐中，這種切換通常發(fā)生在300和350nm之間的掃描范圍，其中來(lái)自兩個(gè)光源的光發(fā)射相似，并且可以更平滑地進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

2、波長(zhǎng)選擇

在下一步中，須從光源發(fā)出的寬波長(zhǎng)中選擇適合用于檢測(cè)的樣品類型和分析物的特定波長(zhǎng)的光進(jìn)行樣品檢查。常用的方法包括：

• 單色器

  單色器將光分成窄的波長(zhǎng)帶。它通?；诳梢孕D(zhuǎn)的衍射光柵來(lái)選擇入射角和反射角，從而選擇所需的光波長(zhǎng)。衍射光柵的凹槽頻率通常以每毫米的凹槽數(shù)來(lái)衡量。更高的凹槽頻率提供更好的光學(xué)分辨率，但可用波長(zhǎng)范圍更窄。較低的凹槽頻率提供較大的可用波長(zhǎng)范圍，但光學(xué)分辨率較差。每毫米300到2000個(gè)凹槽可用于紫外可見(jiàn)光譜目的，但通常每毫米至少有1200個(gè)凹槽。光譜測(cè)量的質(zhì)量對(duì)衍射光柵和光學(xué)裝置中的物理缺陷很敏感。因此，刻劃衍射光柵往往比閃耀全息衍射光柵具有更多的缺陷。閃耀全息衍射光柵往往能提供明顯更好的測(cè)量質(zhì)量。

• 吸收濾光片

  吸收濾光片通常由有色玻璃或塑料制成，旨在吸收特定波長(zhǎng)的光。

• 干涉濾光片

  也稱為二向色濾光片，這些常用的濾光片由多層介電材料制成，其中在薄層材料之間發(fā)生干涉。這些濾光片可用于通過(guò)相消干涉除不需要的波長(zhǎng)，從而充當(dāng)波長(zhǎng)選擇器。

• 截止濾光片
  截止濾光片允許低于（短波）或高于（長(zhǎng)波）特定波長(zhǎng)的光通過(guò)。這些通常使用干涉濾波器來(lái)實(shí)現(xiàn)。

• 帶通濾波器

  帶通濾波器允許一系列波長(zhǎng)通過(guò)，這可以通過(guò)將短波和長(zhǎng)波濾波器組合在一起來(lái)實(shí)現(xiàn)。

  由于其多功能性，單色儀常用于該過(guò)程。然而，濾光片通常與單色器一起使用，以縮小選擇的光波長(zhǎng)以進(jìn)行更好的測(cè)量并提高信噪比。

3、樣品分析

無(wú)論在分光光度計(jì)中使用哪種波長(zhǎng)選擇器，光都會(huì)穿過(guò)樣品。對(duì)于所有分析，測(cè)量參考樣品（通常稱為“空白樣品”）（例如裝有用于制備樣品的類似溶劑的比色皿）是必不可少的。如果使用含有樣品的緩沖溶液進(jìn)行測(cè)量，則使用不含目標(biāo)物質(zhì)的緩沖溶液作為參考。檢查細(xì)菌培養(yǎng)物時(shí)，將使用無(wú)菌培養(yǎng)基作為參考。參考樣品信號(hào)隨后由儀器自動(dòng)使用，以幫助獲得分析物的真實(shí)吸光度值。

了解UV-Vis光譜實(shí)驗(yàn)中使用的材料和條件非常重要。例如，大多數(shù)塑料比色皿不適用于紫外線吸收研究，因?yàn)樗芰贤ǔ?huì)吸收紫外線。玻璃可以充當(dāng)過(guò)濾器，通常會(huì)吸收大部分UVC(100-280nm)和UVB(280-315nm)但允許一些UVA(315-400nm)通過(guò)。因此，紫外檢測(cè)需要石英樣品架，因?yàn)槭?duì)大部分紫外光是透明的?？諝庖部梢员徽J(rèn)為是一種過(guò)濾器，因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)短于約200nm的光被空氣中的分子氧吸收。波長(zhǎng)小于200nm的測(cè)量需要特殊且更昂貴的設(shè)置，通常涉及充滿純氬氣的光學(xué)系統(tǒng)。色皿系統(tǒng)也可用于分析非常小的樣品體積，例如在DNA或RNA分析中。

4、檢測(cè)

光線穿過(guò)樣品后，檢測(cè)器用于將光線轉(zhuǎn)換為可讀的電子信號(hào)。通常，探測(cè)器基于光電涂層或半導(dǎo)體。

光電涂層在暴露于光噴出帶負(fù)電荷的電子。當(dāng)電子被射出時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與光強(qiáng)成正比的電流。光電倍增管(PMT)是紫外-可見(jiàn)光譜中較常用的檢測(cè)器之一。參考下圖2，PMT基于光電效應(yīng)，在曝光時(shí)首先發(fā)射電子，隨后發(fā)射的電子依次倍增以產(chǎn)生更大的電流。PMT檢測(cè)器對(duì)于檢測(cè)非常低的光強(qiáng)度特別有用。

當(dāng)半導(dǎo)體暴露在光下時(shí)，可以通過(guò)與光強(qiáng)成正比的電流。更具體地說(shuō)，光電二和電荷耦合器件(CCD)是兩種常見(jiàn)的基于半導(dǎo)體技術(shù)的檢測(cè)器。

使用任何探測(cè)器產(chǎn)生電流后，信號(hào)就會(huì)被識(shí)別并輸出到計(jì)算機(jī)或屏幕上。如上圖2和下圖3顯示了紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)布置的一些簡(jiǎn)化示意圖。

圖2：基于比色皿的紫外-可見(jiàn)光譜系統(tǒng)示意圖。

圖3：色皿UV-Vis光譜系統(tǒng)示意圖。

紫外-可見(jiàn)光譜分析、吸收光譜和吸光度單位

UV-Vis光譜信息可以表示為吸光度、光密度或透射率與波長(zhǎng)的函數(shù)關(guān)系圖。但是，該信息通常以y軸（縱軸）上的吸光度和x軸（橫軸）上的波長(zhǎng)的圖形形式呈現(xiàn)。該圖通常稱為吸收光譜，如下圖4所示。

圖4：從紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)獲取的吸收光譜圖。檢查的樣品是溶解在中性pH磷酸鹽緩沖液中的血紅蛋白。

根據(jù)本文前一節(jié)中介紹的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)儀，可以合理地預(yù)期光強(qiáng)度與樣品吸收的光量定量相關(guān)。

吸光度（A）等于涉及的光的強(qiáng)度通過(guò)樣品之前的對(duì)數(shù)值（Io）通過(guò)的光的強(qiáng)度通過(guò)樣品（I）。I除以Io的分?jǐn)?shù)也稱為透射率(T)，它表示通過(guò)樣品的光量。然而，當(dāng)摩爾吸光率(ε)和路徑長(zhǎng)度(L)已知時(shí)，比爾-朗伯定律（Beer-Lambert）通常用于在測(cè)量吸光度(A)后獲得樣品的濃度(c)。通常，ε以L﹒mol-1cm-1為單位表示，L以cm為單位，c以mol/L為單位表示。因此，A沒(méi)有單位。

有時(shí)AU用于表示任意單位或吸光度單位，但一般建議不要這樣表示。

如果使用一組測(cè)量的包含相同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液存在線性關(guān)系，Beer-Lambert定律對(duì)于獲得物質(zhì)的濃度特別有用。公式1顯示了吸光度、比爾-朗伯定律、儀器中測(cè)量的光強(qiáng)度和透射率之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。

公式1：此方程顯示了吸光度A、比爾-朗伯定律、儀器中測(cè)量的光強(qiáng)度和透射率之間的關(guān)系。

光密度(OD)有時(shí)會(huì)錯(cuò)誤地與吸光度互換使用。OD和吸光度都測(cè)量光學(xué)組件中光強(qiáng)度損失的量，但OD考慮了光散射的損失，而吸光度則沒(méi)有。如果測(cè)量中存在非常少的光散射，則可以使用吸光度直接近似估計(jì)OD，并且可以使用Beer-Lambert定律。

在測(cè)量過(guò)程中了解實(shí)驗(yàn)條件很重要。用于1cm路徑長(zhǎng)度的比色皿是標(biāo)準(zhǔn)的并且是常見(jiàn)的。有時(shí)，可用于檢查的樣本非常少，因此需要小至1毫米的較短路徑長(zhǎng)度。如果需要定量，吸光度值應(yīng)保持在1以下，并且保持在儀器的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。這是因?yàn)槲舛葹?意味著樣品吸收了90%的入射光，或者等效地表述為10%的入射光透過(guò)樣品。由于到達(dá)檢測(cè)器的光很少，一些紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)不夠靈敏，無(wú)法可靠地量化少量光。解決這個(gè)問(wèn)題的兩個(gè)簡(jiǎn)單可能的解決方案是稀釋樣品或減少路徑長(zhǎng)度。

如上所述，使用“空白”參考溶液記錄基線光譜是必不可少的。如果儀器在各方面都好，那么基線對(duì)每個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)的吸光度都為零。然而，在實(shí)際情況下，基線光譜通常會(huì)有一些非常小的正負(fù)吸光度值。為實(shí)現(xiàn)實(shí)踐，軟件通常會(huì)自動(dòng)從每個(gè)光波長(zhǎng)的樣品吸光度值中減去這些小的吸光度值，以獲得真實(shí)的吸光度值。

根據(jù)分析的目的，可能需要構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。建立校準(zhǔn)曲線需要一些數(shù)據(jù)分析和額外的工作，但根據(jù)吸光度測(cè)量值準(zhǔn)確確定樣品中特定物質(zhì)的濃度非常有用。然而，在許多情況下不需要校準(zhǔn)曲線，包括用于細(xì)菌培養(yǎng)的OD測(cè)量、在特定波長(zhǎng)處獲取吸光度比以評(píng)估核酸純度或識(shí)別某些藥物。

在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，選擇對(duì)應(yīng)于目標(biāo)物質(zhì)大吸光度的波長(zhǎng)進(jìn)行分析。這種選擇確保了大的靈敏度，因?yàn)閷?duì)于特定的分析物濃度可以獲得大的響應(yīng)。下圖5提供了Food Green 3（一種染料）的UV-Vis吸收光譜示例和使用標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)校準(zhǔn)曲線。請(qǐng)注意，F(xiàn)ood Green 3染料中存在兩個(gè)大吸收峰，一個(gè)較小的大吸收峰位于435nm，在619nm處有一個(gè)更強(qiáng)烈的大吸收峰。為了在計(jì)算未知濃度的Food Green 3時(shí)獲得大靈敏度，使用619nm處的大吸光度峰進(jìn)行分析。通過(guò)稀釋溶液，進(jìn)行吸光度測(cè)量，然后將它們繪制在吸光度與濃度的關(guān)系圖上，以建立濃度和吸光度之間的數(shù)值關(guān)系，從而制備了一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用小二乘線性回歸方程創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)點(diǎn)越接近直線，擬合越好。直線方程中的y截距設(shè)置為零以表示當(dāng)不存在染料時(shí)沒(méi)有吸光度。下圖5中所示的方程用于根據(jù)測(cè)得的吸光度（變量y）計(jì)算未知樣品中Food Green 3（變量x）的濃度。

圖5：左圖顯示了從樣品中的Food Green 3的UV-Vis光譜。右圖顯示的校準(zhǔn)曲線，使用小二乘線性回歸方程從Food Green 3的標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液中得出的。

對(duì)于數(shù)據(jù)分析，吸光度與濃度的關(guān)系圖可以表明系統(tǒng)在構(gòu)建校準(zhǔn)曲線時(shí)的靈敏度。當(dāng)使用線性小二乘回歸方程時(shí)，擬合線的斜率表示靈敏度。如果斜率更陡，則靈敏度更高。靈敏度是區(qū)分樣品濃度微小差異的能力。根據(jù) Beer-Lambert 定律，靈敏度可以部分地由摩爾吸收率ε 表示。事先了解ε值（如果有）有助于確定所需樣品的濃度，尤其是在樣品有限或昂貴的情況下。

為了可靠性和實(shí)踐，應(yīng)重復(fù)紫外-可見(jiàn)光譜實(shí)驗(yàn)和讀數(shù)。在重復(fù)檢查樣品時(shí)，通常至少進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)是常見(jiàn)的，但在某些工作領(lǐng)域需要進(jìn)行更多次重復(fù)試驗(yàn)。計(jì)算出的數(shù)量，例如未知樣品的濃度，通常報(bào)告還應(yīng)該帶有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。可重現(xiàn)的結(jié)果對(duì)于確保準(zhǔn)確、高質(zhì)量的測(cè)量至關(guān)重要。標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或變異系數(shù)有助于確定系統(tǒng)和測(cè)量的準(zhǔn)確度，較低的偏差或變化表明較高的精度和可靠性水平。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的優(yōu)勢(shì)和局限性

沒(méi)有一種技術(shù)是好的，紫外-可見(jiàn)光譜也不例外。但是，該技術(shù)確實(shí)具有以下的一些主要優(yōu)勢(shì)，使其應(yīng)用廣泛。

• 該技術(shù)是非破壞性的，允許重復(fù)使用樣品或進(jìn)行進(jìn)一步處理或分析；

• 可以快速進(jìn)行測(cè)量，從而可以輕松集成到實(shí)驗(yàn)方案中；

• 儀器易于使用，使用前幾乎不需要培訓(xùn)；

• 數(shù)據(jù)分析通常需要少許的處理，這同樣意味著需要很少的用戶培訓(xùn)；

• 該儀器的購(gòu)置和操作成本通常較低，因此可供許多實(shí)驗(yàn)室使用。

雖然這種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)看起來(lái)非常明顯，但也存在一定的弱點(diǎn)：

• 雜散光

  在實(shí)際儀器中，波長(zhǎng)選擇器并不好，來(lái)自寬波長(zhǎng)范圍的少量光仍可能從光源傳輸，這可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的測(cè)量錯(cuò)誤。雜散光也可能來(lái)自環(huán)境或儀器中安裝松散的隔間。

• 光散射

  光散射通常是由液體樣品中的懸浮固體引起的，這可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的測(cè)量誤差。比色皿或樣品中存在的氣泡會(huì)散射光，導(dǎo)致無(wú)法重現(xiàn)的結(jié)果。

• 來(lái)自多個(gè)吸收物種的干擾

  例如，樣品可以具有多種類型的綠色葉綠素。在同一樣品中一起檢查時(shí)，不同的葉綠素將具有重疊的光譜。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩糠治?，?yīng)將每種化學(xué)物質(zhì)從樣品中分離出來(lái)并單獨(dú)檢查。

• 組件的偏差

  任何儀器組件未對(duì)準(zhǔn)定位，尤其是固定樣品的比色皿，都可能產(chǎn)生不可重復(fù)和不準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，重要的是儀器中的每個(gè)組件都以相同的方向?qū)R，并在每次測(cè)量時(shí)放置在相同的位置。因此，一般建議進(jìn)行一些基本的操作培訓(xùn)，以避免誤差。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的應(yīng)用 

UV-Vis已發(fā)現(xiàn)其適用于許多用途和情況，包括但不限于：

1、DNA和RNA分析

快速驗(yàn)證RNA和DNA的純度和濃度是一種特別廣泛的應(yīng)用。下表1中給出了分析中使用的波長(zhǎng)及其指示的摘要。在制備DNA或RNA樣品時(shí)，例如用于測(cè)序等下游應(yīng)用時(shí)，通常重要的是要驗(yàn)證其中一個(gè)樣品沒(méi)有被其他，或從分離過(guò)程中攜帶的蛋白質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)。

260nm/280nm吸光度(260/280)比值可用于揭示核酸樣品中可能存在的污染，如下表2所示。純DNA的260/280比值通常為1.8，而純RNA的比值通常為2.0 .純DNA的260/280比值低于RNA，因?yàn)樵赗NA中被尿嘧啶取代的胸腺嘧啶的260/280比值低于尿嘧啶。由于280nm處的吸光度較高，被蛋白質(zhì)污染的樣品會(huì)降低260/280比值。

表1：確定260/280和260/230吸光度比值時(shí)有用的UV吸光度匯總。

表2：DNA和RNA分析的預(yù)期紫外線吸光度比值總結(jié)。

260nm/230nm吸光度(260/230)比率也可用于檢查DNA和RNA樣品的純度，并可揭示蛋白質(zhì)或化學(xué)污染。蛋白質(zhì)可以吸收230nm的光，從而降低260/230比率并指示DNA和RNA樣品中的蛋白質(zhì)污染。硫氰酸胍和異硫氰酸胍是純化核酸中常用的兩種化合物，在230nm處有強(qiáng)烈吸收，這也會(huì)降低260/230的吸光度比值。

2、藥物分析

UV-Vis光譜常見(jiàn)的用途之一是在制藥行業(yè)。使用數(shù)學(xué)導(dǎo)數(shù)處理UV-Vis光譜允許解析原始光譜中的重疊吸收峰以識(shí)別單個(gè)藥物化合物。例如，苯佐卡因（一種局部麻醉劑）和金霉素（一種抗生）可以通過(guò)將一個(gè)數(shù)學(xué)導(dǎo)數(shù)應(yīng)用于吸光度光譜，同時(shí)在商業(yè)獸用粉末制劑中進(jìn)行鑒定。通過(guò)為每種化合物構(gòu)建校準(zhǔn)函數(shù)，可以在微克/毫升的濃度范圍內(nèi)同時(shí)定量這兩種物質(zhì)。

3、細(xì)菌培養(yǎng)

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)常用于細(xì)菌培養(yǎng)。OD測(cè)量通常使用600nm的波長(zhǎng)快速進(jìn)行，以估計(jì)細(xì)胞濃度并跟蹤生長(zhǎng)。600nm是常用和優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谄渲猩L(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)基的光學(xué)特性以及避免在需要繼續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下?lián)p壞細(xì)胞。

4、飲料分析

識(shí)別飲料中的特定化合物是紫外可見(jiàn)光譜的另一個(gè)常見(jiàn)應(yīng)用。含量須在一定的法律限制內(nèi)，紫外線可以促進(jìn)量化。某些類別的有色物質(zhì)，例如在藍(lán)莓、覆盆子、黑莓和櫻桃中發(fā)現(xiàn)的花青素，可以通過(guò)匹配它們?cè)谄咸丫浦械囊阎逯滴詹ㄩL(zhǎng)來(lái)輕松識(shí)別，以便使用紫外可見(jiàn)吸收進(jìn)行質(zhì)量控制。

5、其他應(yīng)用

這種技術(shù)也可用于許多其他行業(yè)。例如，測(cè)量顏色指數(shù)可用于監(jiān)控變壓器油，作為確保電力輸送的預(yù)防措施。測(cè)量血紅蛋白的吸光度以確定血紅蛋白濃度可用于癌癥研究。在廢水處理中，UV-Vis光譜可用于動(dòng)力學(xué)和監(jiān)測(cè)研究，通過(guò)比較一段時(shí)間內(nèi)的光譜，確保某些染料或染料副產(chǎn)品已被正確去除。

UV-Vis光譜在一些更專業(yè)的研究中也非常有用。在對(duì)應(yīng)于吸收峰的波長(zhǎng)的跟蹤變化是在檢查特定結(jié)構(gòu)蛋白改變有用和在確定電池組合物。峰值吸收波長(zhǎng)的偏移也可用于更現(xiàn)代的應(yīng)用，例如非常小的納米粒子的表征。這種技術(shù)的應(yīng)用多種多樣，而且似乎無(wú)窮無(wú)盡。